Levná biotiskárna: 13 kroků (s obrázky)

2024 Autor: John Day | [email protected]. Naposledy změněno: 2024-01-30 08:21

Jsme výzkumným týmem vedeným pod úrovní výzkumu v UC Davis. Jsme součástí skupiny BioInnovation Group, která působí v laboratoři TEAM Molecular Prototyping and BioInnovation Lab (poradci Dr. Marc Facciotti a Andrew Yao, M. S.). Laboratoř sdružuje studenty různého původu, aby pracovali na tomto projektu (mech/chemické/biomedicínské inženýrství).

Trochu pozadí tohoto projektu je, že jsme zahájili tisk transgenních rýžových buněk ve spolupráci s Dr. Karen McDonaldovou z oddělení ChemE s cílem vyvinout levnou biotiskárnu, aby byl biotisk přístupnější výzkumným institucím. V současné době stojí biotiskárny nižší kategorie přibližně 10 000 USD, zatímco špičkové biotiskárny stojí přibližně 170 000 USD. Naproti tomu naši tiskárnu lze postavit přibližně za 375 USD.

Zásoby

Díly:

1. Rampy 1.4:
2. Arduino mega 2560:
3. Ovladače krokových motorů:
4. Další krokový motor (volitelný)
5. Tvůrce paprsku 2 v X 1 palce
6. Hardware pro uchycení paprsku výrobce
7. Šrouby M3 různých velikostí
8. Matice M3 x2
9. 8 mm závitová tyč
10. Matice 8 mm
11. Ložisko 608
12. Pořadačový klip
13. Vlákno
14. Monoprice V2
15. Kravaty na zip
16. Tepelně tuhnoucí matice M3 o šířce 2 mm

Nástroje:

1. Vrtáky různých velikostí
2. Ruční vrtačka
3. Vrtačka
4. Pilka na kov
5. Páječka + pájka
6. Odstraňovač drátů
7. Jehlové kleště
8. Šestihranné klíče různých velikostí

Laboratorní potřeby:

1. Petriho misky o průměru 70 mm
2. 60 ml stříkačka se špičkou Luer-lock
3. 10 ml stříkačka se špičkou Luer-lock
4. Kování Luer-lock
5. Hadice pro tvarovky
6. T konektor pro hadičky
7. Odstředivka
8. Centrifugační zkumavky 60 ml
9. Měřítko
10. Odvažte lodě
11. Autokláv
12. Kádinky
13. Odměrný válec se stupnicí
14. 0,1M roztok CaCl2
15. Agarose
16. Alginát
17. Methylcelulóza
18. Sacharóza

Software:

1. Fusion 360 nebo Solidworks
2. Arduino IDE
3. Repetier Host
4. Ultimaker Cura 4

Krok 1: Výběr 3D tiskárny

Jako počáteční 3D tiskárnu jsme vybrali Monoprice MP Select Mini 3D Printer V2. Tato tiskárna byla vybrána kvůli nízkým nákladům a vysoké dostupnosti. Kromě toho již byl k dispozici vysoce přesný 3D model tiskárny, který usnadnil návrh. Tento instruktáž bude přizpůsoben pro tuto konkrétní tiskárnu, ale podobný proces lze použít k převodu dalších běžných tiskáren FDM a CNC strojů.

Model s vysokou přesností:

Krok 2: 3D tisk

Před demontáží tiskárny Monoprice je třeba několik dílů 3D vytisknout pro úpravu 3D tiskárny. Existují verze extruderů pasty, jedna, která vyžaduje epoxid a druhá ne. Ten, který vyžaduje epoxid, je kompaktnější, ale jeho montáž je obtížnější.

Krok 3: Připravte tiskárnu na úpravu

Přední panel věže, spodní kryt a ovládací panel by měly být odstraněny. Jakmile je spodní část odstraněna, odpojte veškerou elektroniku od řídicí desky a vyjměte řídicí desku.

Krok 4: Výměnný držák

Těleso 1 a tělo 14 vyžadují dvě tepelně nastavitelné matice. Tělo 1 je připevněno k rámu tiskárny pomocí dvou šroubů M3 skrytých pod pásem. Šrouby lze odhalit odstraněním napínáku řemene a zatažením pásu na jednu stranu.

Krok 5: Přepínač osy Z

Přepínač osy Z je přemístěn tak, aby během naváděcí sekvence bylo možné použít jehlu libovolné délky bez kompenzace v softwaru. Přepínač by měl být namontován pomocí 2 šroubů M3 na šasi tiskárny přímo pod tiskovou hlavu co nejblíže tiskové ploše.

Krok 6: Zapojení

Zapojení je provedeno v souladu s normami Ramps 1.4. Jednoduše postupujte podle schématu zapojení. Odřízněte a pocínujte vodiče podle potřeby pro svorkovnice. Některé vodiče je třeba prodloužit.

Krok 7: Epoxidový extrudér

Tisk tohoto extruderu trvá kratší dobu, ale používá epoxid, což zvyšuje celkovou dobu výroby na více než 24 hodin. 8mm závitová tyč by měla být epoxidována na ložisko 608 a ložisko by mělo být epoxidováno na 3D tištěný kus tělesa 21. Kromě toho by měla být matice pro závitovou tyč epoxidována na tělo 40. Jakmile je epoxid plně vytvrzen, guma špičky z 60ml a 10ml pístu stříkačky lze nasadit na Tělo 9, respektive Tělo 21. Nebylo možné najít vhodnou tvarovku T, takže hrubý byl vyroben z 6mm mosazné trubky a pájky. Extrudér funguje jako hydraulický systém, který vytlačuje Bioink ze spodní komory 10ml stříkačky. Vzduch lze ze systému vyprázdnit energickým protřepáním trubek, přičemž držte tvarovku T v nejvyšším bodě.

Krok 8: Pravidelný extruder pro vkládání

Tento extruder lze jednoduše sešroubovat. Nevýhodou tohoto extruderu je, že je objemnější a má vysokou vůli.

Krok 9: Krok 9: Firmware Arduino

Arduino potřebuje firmware ke spuštění krokových ovladačů a další elektroniky. Vybrali jsme si Marlin, protože je zdarma, snadno upravitelný pomocí Arduino IDE a dobře podporovaný. Upravili jsme firmware pro náš konkrétní hardware, ale je velmi jednoduché jej upravit pro jiné tiskárny, protože celý kód je komentován a jasně vysvětlen. Poklepáním na soubor MonopriceV2BioprinterFirmware.ino otevřete konfigurační soubory marlin.

Krok 10: Profil Cura

Profil Cura lze importovat do Ultimakeru Cura 4.0.0 a použít k výrobě sítí s velkým povrchem pro použití v profúzním reaktoru. Generování Gcode pro tiskárnu je stále velmi experimentální a vyžaduje hodně trpělivosti. Také je připojen testovací kód pro cirkulární profúzní reaktor.

Krok 11: Změna Start G-kódu

Vložte tento kód do úvodního nastavení G-kódu:

G1 Z15

G28

G1 Z20 F3000

G92 Z33.7

G90

M82

G92 E0

V Repetieru můžete pro spuštění Gcode upravit slicer-> Configuration-> G-codes-> start G-codes. Je nutné upravit hodnotu G92 Z pro každý konkrétní případ. Pomalu zvyšujte hodnotu, dokud nebude jehla na začátku tisku v požadované vzdálenosti od povrchu Petriho misky.

Krok 12: Vytvoření Bioink

Proces vývoje Bioink vhodného pro aplikaci je složitý. Toto je proces, který jsme sledovali:

souhrn

Hydrogel je vhodný pro rostlinné buňky citlivé na střih a má otevřené makropóry, které umožňují difúzi. Hydrogel se vyrábí rozpuštěním agarózy, alginátu, methylcelulózy a sacharózy v deionizované vodě a přidáním buněk. Gel je viskózní, dokud není vytvrzen 0,1M chloridem vápenatým, díky čemuž je pevný. Vytvrzovací roztok chloridu vápenatého se zesíťuje s alginátem, aby byl pevný. Alginát je základem gelu, methylcelulóza gel homogenizuje a agaróza poskytuje větší strukturu, protože při pokojové teplotě gelovatí. Sacharóza poskytuje buňkám potravu pro další růst v hydrogelu.

Stručný přehled některých experimentů k ověření gelu

Testovali jsme různé hydrogely s různým množstvím agarózy a zaznamenali jsme její konzistenci, jak snadno se tiskla a zda se v vytvrzovacím roztoku potopila nebo vznášela. Snížení procenta alginátu způsobilo, že gel byl příliš tekutý a po tisku nebyl schopen udržet svůj tvar. Zvýšení procenta alginátu způsobilo, že vytvrzovací roztok pracoval tak rychle, že se gel vytvrdil, než se nalepil na horní vrstvu. Hydrogel, který drží tvar a nevytvrzuje se příliš rychle, byl vyvinut s použitím 2,8% hmotnostních alginátu.

Jak vyvinout hydrogel

Materiály

Agaróza (0,9 %hmotn.)

Alginát (2,8 %hmotn.)

Methylcelulóza (3,0%hmotn.)

Sacharóza (3,0%hmotn.)

Chlorid vápenatý.1M (147,001 g/mol)

ddH20

agregáty buněk

2 umyté a sušené kádinky

1 míchací špachtle

Hliníková fólie

Papír na vážení plastů

Odměrný válec se stupnicí

Postup

Výroba hydrogelu:

1. Změřte konkrétní množství ddH20 podle toho, kolik gelového roztoku chcete připravit. Pomocí odměrného válce získáte konkrétní objem ddH20.
2. Hydrogelový roztok bude obsahovat alginát (2,8 %hmotnostních)), agarózu (0,9 %hmotnostních), sacharózu (3 %hmotnostní) a methylcelulózu (3 %hmotnostní). Správné podíly složek roztoku hydrogelu budou měřeny pomocí plastového vážicího papíru.
3. Po zvážení všech složek přidejte do jedné ze suchých kádinek ddh20, sacharózu, agarózu a nakonec alginát sodný. Mícháním krouživým pohybem míchejte, ale k míchání nepoužívejte špachtli, protože prášek se na špachtli přilepí.
4. Po promíchání obalte horní část kádinky hliníkovou fólií a kádinku označte. Na horní část fólie přidejte kousek autoklávové pásky.
5. Zbylou methylcelulózu vložte do druhé suché kádinky a zabalte ji do hliníkové fólie jako předchozí kádinka. Označte tuto kádinku a přidejte kousek autoklávové pásky na horní část fólie.
6. Zabalte 1 špachtli do hliníkové fólie a ujistěte se, že žádná z nich není odkrytá. Do zabalené špachtle přidejte pásku z autoklávu.
7. Autoklávujte 2 kádinky a 1 špachtli při 121 C po dobu sterilizačního cyklu. NEPOUŽÍVEJTE AUTOCLAV v STERILNÍM A SUCHÉM CYKLU.
8. Jakmile je cyklus autoklávu dokončen, nechte gel vychladnout na pokojovou teplotu a jakmile ho dosáhne, začněte pracovat v kabinetu biologické bezpečnosti.
9. Jakmile pracujete ve skříni biologické bezpečnosti, nezapomeňte si umýt ruce a paže a používat správnou aseptickou techniku. Dbejte také na to, aby se nedostaly do přímého kontaktu s předměty, které se budou dotýkat gelu nebo se budou nacházet v blízkosti gelu (např. Míchací konec špachtle nebo oblast hliníkových fólií, která sedí nad gelem)
10. V kabině pro biologickou bezpečnost přimíchejte methylcelulózu do gelu, aby se dosáhlo homogenního šíření. Jakmile je míchání hotové, znovu zabalte smíšený gelový roztok a vložte do chladničky přes noc.
11. Odtud lze gel použít pro zavedení buněk nebo pro jiná použití, jako je tisk.

Přidání buněk:

1. Buňky filtrujte, aby měly stejnou velikost. Náš postup pro filtrování je

   Buňky lehce seškrábněte z Petriho misky a použijte 380 mikrometrové síto k filtraci buněk.

2. Jemně promíchejte filtrované buňky v hydrogelovém roztoku pomocí špachtle s plochou hlavou, aby nedošlo ke ztrátě směsi (které byly autoklávovány).
3. Po smíchání buněk odstřeďte bubliny
4. Odtud je hydrogel kompletní a lze jej použít pro tisk, vytvrzování a budoucí experimenty.

Jak vyvinout vytvrzovací roztok (0,1 M chlorid vápenatý, CaCl2)

Materiály

Chlorid vápenatý

ddH20

Sacharóza (3 hm. %)

Postup (příprava 1L vytvrzovacího roztoku)

1. Změřte 147,01 g chloridu vápenatého, 30 ml sacharózy a 1 litr ddH20.
2. Smíchejte chlorid vápenatý, sacharózu a ddH20 ve velké kádince nebo nádobě.
3. Ponořte gel do vytvrzovacího roztoku po dobu nejméně 10 minut, aby se vytvrdil.

Krok 13: Tisk

Bioprinting je teoreticky extrémně jednoduchý; v praxi však existuje mnoho faktorů, které mohou způsobit selhání. S tímto gelem jsme zjistili, že pro maximální úspěch naší aplikace lze udělat několik věcí:

1. Použijte malé množství roztoku CaCl2 k částečnému vytvrzení gelu během tisku,
2. Ke zvýšení přilnavosti použijte na dně Petriho misky papírový ručník
3. Pomocí papírového ručníku rovnoměrně rozetřete malá množství CaCl2 na celý tisk
4. pomocí posuvníku průtoku v Repetieru najděte správný průtok

Pro různé aplikace a různé gely může být nutné použít různé techniky. Náš postup byl generován několik měsíců. Trpělivost je klíčová.

Hodně štěstí, pokud se o tento projekt pokusíte a můžete se na cokoli zeptat.

První cena v Arduino Contestu 2019