Gigapixelový mikroskop pro stolní počítače: 10 kroků (s obrázky)

2024 Autor: John Day | [email protected]. Naposledy změněno: 2024-01-30 08:22

V optických mikroskopech existuje zásadní kompromis mezi zorným polem a rozlišením: čím jemnější detaily, tím menší je oblast zobrazovaná mikroskopem. Jedním ze způsobů, jak překonat toto omezení, je přeložit vzorek a získat obrázky ve větším zorném poli. Základní myšlenkou je spojit mnoho obrázků s vysokým rozlišením a vytvořit tak velký FOV. Na těchto obrázcích uvidíte jak celý vzorek, tak jemné detaily v jakékoli části vzorku. Výsledkem je obrázek skládající se z přibližně miliardy pixelů, mnohem větší ve srovnání se snímky pořízenými fotoaparátem dSLR nebo chytrým telefonem, které obvykle mají přibližně 10 až 50 milionů pixelů. Podívejte se na tyto gigapixelové krajiny a získejte působivou ukázku obrovského množství informací na těchto obrázcích.

V tomto návodu se budu zabývat tím, jak postavit mikroskop schopný zobrazovat zorné pole 90 mm x 60 mm s pixely odpovídajícími 2 μm na vzorku (i když si myslím, že rozlišení je pravděpodobně blíže 15 μm). Systém používá čočky fotoaparátu, ale stejný koncept lze použít pomocí mikroskopických objektivů, abyste získali ještě jemnější rozlišení.

Na EasyZoom jsem nahrál gigapixelové obrázky, které jsem získal mikroskopem:

1970 Obrázek časopisu National Geographic

Háčkovaný ubrus, který vyrobila moje žena

Různá elektronika

Další zdroje:

Návody k optické mikroskopii:

Optické rozlišení:

Kromě spojování obrazu umožňuje nedávný pokrok ve výpočetním zobrazování gigapixelovou mikroskopii, aniž by se vzorek dokonce hýbal!

Krok 1: Seznam dodávek

Materiály:

1. Nikon dSLR (použil jsem svůj Nikon D5000)

2. Objektiv s ohniskovou vzdáleností 28 mm se závitem 52 mm

3. Objektiv s ohniskovou vzdáleností 80 mm a závitem 58 mm

4. Reverzní spojka 52 mm až 58 mm

5. Stativ

6. Sedm listů překližky o tloušťce 3 mm

7. Arduino Nano

8. Dva H-můstky L9110

9. Dva IR zářiče

10. Dva IR přijímače

11. Stiskněte tlačítko

12. Dva odpory 2,2 kOhm

13. Dva 150Ohm odpory

14. Jeden odpor 1 kOhm

15. Dálkové uvolnění pro fotoaparát Nikon

16. Černá plakátová tabule

17. Sada hardwaru:

18. Dva krokové motory (použil jsem Nema 17 bipolární krokový motor 3,5 V 1A)

19. Dva 2mm vodicí šrouby

20. Čtyři polštářové bloky

21. Dvě matice vodícího šroubu

22. Dvě kluzná pouzdra ložisek a 200 mm lineární hřídele:

23. Napájení 5V:

24. Drát ovinutý drátem

Nástroje:

1. Laserová řezačka

2. 3D tiskárna

3. Imbusové klíče

4. Nůžky na drát

5. Nástroj na ovinutí drátu

Krok 2: Přehled systému

K překladu vzorku přesouvají dva krokové motory zarovnané v ortogonálních směrech stupeň ve směru x a y. Motory jsou ovládány pomocí dvou H-můstků a Arduina. IR senzor umístěný na základně krokového motoru slouží k vynulování stupňů, aby nenarazily na žádný konec bloků. Digitální mikroskop je umístěn nad stolem XY.

Jakmile je vzorek umístěn a fáze je vystředěna, stisknutím tlačítka zahájíte pořizování. Motory přesunou pódium do dolního levého rohu a spustí se kamera. Motory poté v malých krocích překládají vzorek, zatímco fotoaparát pořizuje fotografii v každé poloze.

Poté, co jsou pořízeny všechny snímky, jsou snímky spojeny dohromady a vytvoří gigapixelový obraz.

Krok 3: Sestavení mikroskopu

Vyrobil jsem mikroskop s malým zvětšením s dSLR (Nikon 5000), objektivem Nikon 28 mm f/2,8 a objektivem Nikon se zoomem 28-80 mm. Objektiv se zoomem byl nastaven na ohniskovou vzdálenost rovnou 80 mm. Sada těchto dvou čoček funguje jako čočka mikroskopu a čočka objektivu. Celkové zvětšení je poměr ohniskových vzdáleností, přibližně 3X. Tyto čočky opravdu nejsou určeny pro tuto konfiguraci, takže aby se světlo šířilo jako mikroskop, musíte mezi obě čočky umístit doraz clony.

Nejprve na fotoaparát nasaďte objektiv s delší ohniskovou vzdáleností. Vystřihněte kruh z černé plakátové desky, která má průměr zhruba jako přední plocha čočky. Potom uprostřed ustřihněte malý kruh (já jsem vybral průměr asi 3mm). Velikost kruhu určuje množství světla, které vstupuje do systému, nazývané také numerická clona (NA). NA určuje boční rozlišení systému pro dobře navržené mikroskopy. Proč tedy pro toto nastavení nepoužívat vysokou NA? Existují dva hlavní důvody. Za prvé, jak se NA zvyšuje, optické aberace systému se stávají výraznějšími a omezují rozlišení systému. V nekonvenčním nastavení, jako je toto, to pravděpodobně bude tento případ, takže zvýšení NA nakonec již nepomůže zlepšit rozlišení. Za druhé, hloubka pole také závisí na NA. Čím vyšší je NA, tím menší je hloubka ostrosti. To ztěžuje zaostření objektů, které nejsou všechny ploché. Pokud se NA dostane příliš vysoko, pak budete omezeni na zobrazovací mikroskopická sklíčka, která mají tenké vzorky.

Umístění dorazu clony mezi obě čočky činí systém zhruba telecentrickým. To znamená, že zvětšení systému je nezávislé na vzdálenosti objektu. To je důležité pro spojování obrázků dohromady. Pokud má objekt různou hloubku, pak pohled ze dvou různých pozic bude mít posunutou perspektivu (jako lidské vidění). Spojení obrázků dohromady, které nepocházejí z telecentrického zobrazovacího systému, je náročné, zvláště s tak vysokým zvětšením.

Pomocí reverzní spojky objektivu 58 mm až 52 mm připevněte 28 mm objektiv k 80 mm objektivu s clonou umístěnou uprostřed.

Krok 4: XY Stage Design

Stůl jsem navrhl pomocí Fusion 360. Pro každý směr skenování existují čtyři části, které je třeba vytisknout 3D: montážní držák, dva prodlužovače posuvných jednotek a držák vodícího šroubu. Základna a plošiny stupně XY jsou řezány laserem z překližky o tloušťce 3 mm. Základna drží motor a jezdce ve směru X, platforma X drží motor a jezdce ve směru Y a platforma Y drží vzorek. Základna se skládá ze 3 listů a dvě platformy se skládají ze 2 listů. V tomto kroku jsou poskytnuty soubory pro řezání laserem a 3D tisk. Po vystřižení a tisku těchto částí jste připraveni na další kroky.

Krok 5: Sestava držáku motoru

Pomocí nástroje pro ovíjení drátu omotejte vodič kolem vodičů dvou IR vysílačů a dvou IR přijímačů. Barevně označte vodiče, abyste věděli, který konec je který. Potom odřízněte vodiče z diod, takže od té doby vedou pouze dráty pro ovíjení drátu. Protáhněte vodiče vodítky v držáku motoru a poté zatlačte diody na místo. Vodiče jsou vedeny tak, aby nebyly viditelné, dokud neopustí zadní část jednotky. Tyto vodiče lze spojit s vodiči motoru. Nyní namontujte krokový motor pomocí čtyř šroubů M3. Tento krok opakujte pro druhý motor.

Krok 6: Stage Assembly

Přilepte k sobě výřezy podstavce 1 a podstavce 2, jeden s šestihrannými otvory pro matice M3. Jakmile lepidlo zaschne, zatlučte matice M3 na místo. Matice se při zatlačení do desky nebudou otáčet, takže šrouby budete moci zašroubovat později. Nyní přilepte třetí základní list (základ 3), aby zakryl matice.

Nyní je čas sestavit držák olověné matice. Z držáku odstraňte veškerá další vlákna a poté zatlačte čtyři matice M3 na místo. Jsou těsné, takže se ujistěte, že uvolníte prostor pro šroub a matici malým šroubovákem. Jakmile jsou matice zarovnány, zatlačte vodicí matici do držáku a připevněte ji 4 šrouby M3.

Na základnu připevněte bloky polštářů, držáky posuvníků a držák motoru pro lineární překladač ve směru X. Nasaďte sestavu vodicí matice na vodicí šroub a poté vodicí šroub zasuňte na místo. Pomocí spojky připojte motor k vodicímu šroubu. Umístěte posuvné jednotky do tyčí a poté zatlačte tyče do úchytů posuvníku. Nakonec pomocí šroubů M3 připevněte prodlužovací držáky.

Listy překližky X1 a X2 jsou k sobě slepeny podobným způsobem jako základna. Stejný postup se opakuje pro lineární translátor ve směru Y a fázi vzorku.

Krok 7: Elektronika skeneru

Každý krokový motor má čtyři kabely, které jsou připojeny k modulu H-můstku. Čtyři kabely z IR vysílače a přijímače jsou připojeny k rezistorům podle výše uvedeného schématu. Výstupy přijímačů jsou připojeny k analogovému vstupu A0 a A1. Dva moduly H-bridge jsou připojeny ke kolíku 4-11 na Arduino Nano. Tlačítko je připojeno ke kolíku 2 s odporem 1 kOhm pro jednoduchý vstup uživatele.

Nakonec je spouštěcí tlačítko pro dSLR připojeno ke vzdálené závěrce, stejně jako pro můj skener CT (viz krok 7). Odřízněte kabel dálkové závěrky. Vodiče jsou označeny takto:

Žlutá - zaměření

Červená - závěrka

Bílá - zem

Aby bylo možné zaměřit výstřel, musí být žlutý vodič připojen k zemi. Chcete -li pořídit fotografii, musí být žlutý i červený vodič připojen k zemi. Připojil jsem diodu a červený kabel na pin 12 a poté jsem připojil další diodu a žlutý kabel na pin 13. Nastavení je popsáno v instrukcích DIY Hacks a How-Tos.

Krok 8: Pořizování gigapixelových obrázků

V příloze je kód pro gigapixelový mikroskop. K ovládání motorů pomocí H-můstku jsem použil knihovnu Stepper. Na začátku kódu musíte zadat zorné pole mikroskopu a počet obrázků, které chcete získat v každém směru.

Například mikroskop, který jsem vyrobil, měl zorné pole asi 8,2 mm x 5,5 mm. Proto jsem nařídil, aby motory posunuly o 8 mm ve směru x a 5 mm ve směru y. V každém směru je získáno 11 snímků, celkem tedy 121 snímků pro plný gigapixelový obraz (více podrobností o tom v kroku 11). Kód poté vypočítá počet kroků, které musí motory provést k překladu stupně o toto množství.

Jak stupně zjistí, kde jsou vzhledem k motoru? Jak se fáze překládají, aniž by došlo k ukončení? Do instalačního kódu jsem napsal funkci, která přesouvá jeviště v každém směru, dokud nerozbije cestu mezi IR vysílačem a IR přijímačem. Když signál na infračerveném přijímači klesne pod určitou prahovou hodnotu, motor se zastaví. Kód poté sleduje polohu pódia vzhledem k této domovské pozici. Kód je napsán tak, aby se motor nepřekládal příliš daleko, což by způsobilo, že stupeň najede na druhý konec vodícího šroubu.

Jakmile je stupeň zkalibrován v každém směru, je stupeň přeložen do středu. Pomocí stativu jsem umístil mikroskop dSLR nad jeviště. Je důležité zarovnat pole kamery se zkříženými čarami na vzorkovací ploše. Jakmile je scéna zarovnána s kamerou, přelepil jsem pódium malířskou páskou a poté umístil vzorek na pódium. Zaostření bylo upraveno ve směru z na stativu. Uživatel poté stisknutím tlačítka zahájí pořizování. Fáze se překládá do levého dolního rohu a spustí se kamera. Fáze poté rastr naskenuje vzorek, zatímco fotoaparát v každé poloze zachytí fotografii.

Také je připojen nějaký kód pro odstraňování problémů s motory a IR senzory.

Krok 9: Spojení obrázků

Se všemi pořízenými obrázky nyní stojíte před výzvou spojit je všechny dohromady. Jedním ze způsobů, jak zvládnout spojování obrázků, je ruční zarovnání všech obrázků v grafickém programu (použil jsem grafiku Autodesk). To bude určitě fungovat, ale může to být bolestivý proces a okraje obrázků jsou na gigapixelových obrázcích patrné.

Další možností je použít techniky zpracování obrázků k automatickému spojení obrázků. Cílem je najít podobné funkce v překrývající se části sousedních obrázků a poté použít transformaci překladu na obrázek, aby byly obrázky navzájem zarovnány. Nakonec lze hrany smíchat vynásobením překrývající se části lineárním faktorem hmotnosti a sečtením. Pokud jste ve zpracování obrazu nováčkem, může to být skličující algoritmus pro zápis. Chvíli jsem na problému pracoval, ale nemohl jsem získat plně spolehlivý výsledek. Algoritmus se nejvíce potýkal se vzorky, které měly v celém textu velmi podobné rysy, jako například tečky na obrázku časopisu. V příloze je kód, který jsem napsal v Matlabu, ale potřebuje nějakou práci.

Poslední možností je použít programy pro sešívání gigapixelových fotografií. Nemám co navrhovat, ale vím, že jsou venku.

Krok 10: Výkon mikroskopu

Pokud jste to přehlédli, zde jsou výsledky: obrázek časopisu, háčkovaný ubrus a různá elektronika.

Specifikace systému jsou uvedeny v tabulce výše. Zkoušel jsem zobrazovat objektivy s ohniskovou vzdáleností 28 mm i 50 mm. Nejlepší možné rozlišení systému jsem odhadl na základě difrakčního limitu (kolem 6μm). Ve skutečnosti je obtížné to experimentálně testovat bez cíle s vysokým rozlišením. Zkoušel jsem vytisknout vektorový soubor uvedený na tomto velkoformátovém fotografickém fóru, ale byl jsem omezen rozlišením své tiskárny. Nejlepší, co jsem na tomto výtisku mohl určit, bylo, že systém měl rozlišení <40μm. Také jsem na vzorcích hledal malé izolované prvky. Nejmenší funkcí tisku z časopisu je inkoustová skvrna, kterou jsem odhadoval také na přibližně 40 μm, takže jsem ji nemohl použít k získání lepšího odhadu rozlišení. V elektronice byli malí divoti, kteří byli docela dobře izolovaní. Protože jsem znal zorné pole, mohl jsem spočítat počet pixelů zabírajících malý divot, abych získal odhad rozlišení, asi 10-15μm.

Celkově jsem byl s výkonem systému spokojen, ale mám pár poznámek pro případ, že byste si chtěli tento projekt vyzkoušet.

Stabilita pódia: Nejprve získejte vysoce kvalitní lineární komponenty fáze. Komponenty, které jsem použil, měly mnohem větší vůli, než jsem si myslel. Pro každý prut jsem použil v sadě pouze jeden z úchytů posuvníku, takže možná proto se jeviště necítilo příliš stabilní. Fáze pro mě fungovala dost dobře, ale to by se stalo větším problémem pro systémy s vyšším zvětšením.

Optika pro vyšší rozlišení: Stejnou myšlenku lze použít i pro mikroskopy s vyšším zvětšením. Budou však vyžadovány menší motory s jemnější velikostí kroku. Například 20násobné zvětšení s tímto dSLR by mělo za následek zorné pole 1 mm (pokud mikroskop dokáže zobrazit tak velký systém bez vinětace). Společnost Electronupdate použila krokové motory z přehrávače CD v pěkném provedení pro mikroskop s vyšším zvětšením. Dalším kompromisem bude malá hloubka ostrosti, což znamená, že zobrazování bude omezeno na tenké vzorky a budete potřebovat jemnější translační mechanismus ve směru z.

Stabilita stativu: Tento systém by lépe fungoval se stabilnějším držákem fotoaparátu. Systém čoček je těžký a stativ je nakloněn o 90 stupňů z polohy, pro kterou je určen. Abych pomohl se stabilitou, musel jsem sejmout nohy stativu. Závěrka by také mohla s fotoaparátem dostatečně zatřást a rozmazat snímky.